FRONT-AGRO: ELABORACIÓN DE UN INSECTICIDA ORGÁNICO, MEDIANTE EXTRACCIÓN DE TABACO, BARBASCO Y GERANIO, EN EL EXTRACTOR SOXHLET

1. INTRODUCCIÓN

El presente trabajo de laboratorio realizado por los estudiantes de ingeniería agronómica, consistió conocer y aplicar técnicas para la obtención de un insecticida natural u orgánico. Los productos sintéticos destinados a controlar plagas y enfermedades en los vegetales han tenido un rol muy marcado en el incremento de la producción agrícola.

Sin embargo el uso continuo e indiscriminado de estas sustancias, no sólo ha causado enfermedades y muertes por envenenamiento a corto y largo plazo, sino también ha afectado al medio ambiente, acumulándose por bioconcentración en los distintos eslabones de la cadena alimenticia, por lo cual se hace imprescindible el estudio de nuevas vías de control de plagas. Las plantas, en conjunto, producen más de 100.000 sustancias de bajo peso molecular conocidas también como metabolitos secundarios.

Estos son, normalmente, no esenciales para el proceso metabólico básico de la planta. Entre ellos se encuentran terpenos, lignanos, alcaloides, azúcares, esteroides, ácidos grasos, etc. Semejante diversidad química es consecuencia del proceso evolutivo que ha llevado a la selección de especies con mejores defensas contra el ataque microbiano, o la predación de insectos y animales

En el presente trabajo se han planteado los siguientes objetivos:

- Obtener un insecticida orgánico, mediante plantas de la localidad.

- Investigar, conocer y aplicar los distintos beneficios de diversas plantas con el fin de minimizar el uso de los agroquímicos contribuyendo con la conservación de nuestro planeta, implementando la producción agropecuaria natural y orgánica.

- Investigar los múltiples beneficios ofrecidos por algunas plantas, utilizándolos como insecticidas.

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. INSECTICIDAS ORGÁNICOS

FUNSALPRODESE (2000), indica que la acción principal de los insecticidas orgánicos es disminuir el efecto dañino que puedan proporcionar las diferentes clases de insectos que atacan los cultivos; ya sea hortalizas, granos básicos y cultivos no tradicionales.

FONAG (2010), señala que los plaguicidas orgánicos son productos que se derivan de un fruto natural, cuyo procesamiento es mínimo y se los emplea para combatir cualquier plaga en los cultivos. La mayor desventaja que presenta este tipo de plaguicida orgánico es que requiere de más tiempo para poder actuar, su acción no es instantánea y es importante aplicar el elemento cuando aparece el primer indicio de la posible existencia de una plaga en el cultivo. Este tipo de plaguicidas no deben ser expuestos al sol ya que se podría deteriorar los componentes activos, siempre hay que dejarlos a la sombra para macerar o secar.

Las hojas, las semillas, la corteza y la madera pueden resultar tóxicas para los distintos insectos que acechan en las plantaciones. Por eso son seleccionados para utilizarse como plaguicidas. Hay que tener en cuenta un dato muy importante acerca de los plaguicidas naturales: nunca hay que dejarlos expuestos al sol ya que de esta forma se podrían descomponer los componentes activos. Siempre dejarlos a la sombra para macerar o secar. Hay que colar siempre los materiales para de esta forma eliminar todo residuo indeseado para el plaguicida. Si bien los ingredientes utilizados para este tipo de insecticidas naturales no son tóxicos, muchos de los materiales utilizados luego de haber sido procesados y elaborados, pueden llegar a causar serios problemas al ser humano si son inhalados o entran en contacto con la piel o los ojos. Hay que tener el mismo cuidado y precaución que con los plaguicidas químicos. [1]

2.2. INSECTICIDAS NATURALES A PARTIR DE EXTRACTOS VEGETALES

A partir de la necesidad por encontrar una nueva alternativa natural para el control de insectos plagas y reemplazar así los pesticidas sintéticos aparecen los insecticidas botánicos ofreciendo seguridad para el medio ambiente y una eficiente opción agronómica. (Borembaum, 1989). ³

Muchas plantas son capaces de sintetizar metabolitos secundarios que poseen propiedades biológicas con importancia contra insectos plagas. La selección de plantas que contengan metabolitos secundarios capaces de ser utilizados como insecticidas naturales deben ser de fácil cultivo y con principios activos potentes, con alta estabilidad química y de óptima producción. 3

Los principales compuestos aislados de plantas usadas desde hace mucho tiempo para fines insecticidas son:

- La rotenona, extraída de una planta llamada derris, (Derris elliptica y Lonchocarpus utilis, Fam. Leguminosae) es un flavonoide que se extrae de las raíces de estas plantas. De la primera se puede obtener un 13% de rotenona mientras que de la segunda un 5%. Derris es nativa de los trópicos orientales, mientras que Lonchocarpus es del hemisferio occidental. Este compuesto es un insecticida de contacto e ingestión, y repelente. Su modo de acción implica una inhibición del transporte de electrones a nivel de mitocondrias bloqueando la fosforilación del ADP a ATP. Por esto se dice que actúa inhibiendo el metabolismo del insecto. Los síntomas que presentan los insectos intoxicados con rotenona son: disminución del consumo de oxigeno, depresión en la respiración y ataxia que provocan convulsiones y conducen finalmente a la parálisis y muerte del insecto por paro respiratorio (Silva, 2002) ³

- Las piretrinas son esteres con propiedades insecticida obtenidas de las flores del piretro (Chrysantemum cinaerifolium, Fam Compositae). Los componentes de esta planta con actividad insecticida reconocida son seis ésteres, formados por la combinación de los ácidos crisantémico y pirétrico y los alcoholes piretrolona, cinerolona y jasmolona. Estos compuestos atacan tanto el sistema nervioso central como el periférico lo que ocasiona descargas repetidas, seguidas de convulsiones. Diversos estudios han demostrado que estos compuestos taponan las entradas de los iones sodio a los canales, generando que dichos canales sean afectados alterando la conductividad del ión en tránsito. Sin lugar a dudas la característica más importante de estos compuestos es su alto efecto irritante o "knock down" que hace que el insecto apenas entre en contacto con la superficie tratada deje de alimentarse y caiga. Las piretrinas son el mejor ejemplo de la copia y modificación de moléculas en laboratorio porque dieron origen a la familia de los piretroides (Silva, 2002).³

- La nicotina es un alcaloide derivado especialmente de tabaco (Nicotiana tabacum Fam. Solanaceae). Sus propiedades insecticidas fueron reconocidas en la primera mitad del siglo XVI. Este compuesto no se encuentra en la planta en forma libre sino que formando maleatos y citratos. La nicotina es básicamente un insecticida de contacto no persistente. Su modo de acción consiste en mimetizar la acetilcolina al combinarse con su receptor en la membrana postsináptica de la unión neuromuscular. El receptor acetilcolínico, es un sitio de acción de la membrana postsináptica que reacciona con la acetilcolina y altera la permeabilidad de la membrana; la actividad de la nicotina ocasiona la generación de nuevos impulsos que provocan contracciones espasmódicas, convulsiones y finalmente la muerte. 3

- La rianodina se obtiene de los tallos y raices de una planta originaria de América del Sur conocida como Riania speciosa (Fam. Flacourtiaceae). De esta planta se obtiene una serie de alcaloides, siendo el más importante la rianodina. Este alcaloide actúa por contacto y vía estomacal afectando directamente a los músculos impidiendo su contracción y ocasionando parálisis. La planta es utilizada para combatir larvas de diversos lepidópteros que atacan frutos y particularmente la plaga del maíz europeo (Silva, 2002). ³

- La azadirachtina es un tetraterpenoide característico de la familia Meliaceae pero especialmente del árbol Neem (Azadirachta indica), originario de la india. Este compuesto se encuentra en la corteza, hojas y frutos de este árbol pero la mayor concentración se ubica en la semilla. En el extracto se han identificado alrededor de compuestos entre los que destacan salanina, meliantrol y azadiractina que es el que se encuentra en mayor concentración. Muestra acción antialimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la oviposición y esterilizante.(Silva, 2002) ³

- La sebadilla es un compuesto derivado de las semillas de una planta de origen sudamericano conocido como Schoenocaulon officinale (Fam. Liliaceae). Las semillas de esta planta han demostrado tener cantidades importantes de alcaloides que le confieren las propiedades tóxicas. El polvo de estas semillas es uno de los insecticidas vegetales de menor toxicidad para mamíferos pero no así si se aíslan sus alcaloides que pueden llegar a ser altamente tóxicos además de irritantes para la piel. (Silva, 2002). El poliglodial es un sesquiterpeno producido por Polygonum hydropiper ( Fam. Polygonaceae) es usado como un potente inhibidor de la alimentación en afidos (Duke, 1990). ³

- De las Rutales, se han aislado numerosos limonoides (naturales y modificados) de plantas pertenecientes a este orden para estudiar los efectos antialimentarios que provocan sobre especies de insectos plagas pertenecientes a Lepidopteros. (Suresh, G., 2002). 3

Cuadro. Listado de plantas con propiedades insecticidas.3

PLANTA	COMPONENTES PRINCIPALES
Hinojo ( Foeniculum vulgare)	Alfa-pineno, limoneno, apiol, miristiceno, rutina, bergapteno
Perejil ( Pretroselinum crispum)	Alfa-pineno,alfa-terpineol, apiol, estragol, miristiceno, limoneno, rutina
Albahaca ( Ocimum basilicum)	Alfa-pineno,alfa-terpineol, alfa-tujeno, eugenol, limoneno, mentona, anetol, estragol
Coriandro ( Coriandrum sativum)	Alfa-pineno,alfa-terpineol, limoneno, miristicina, rutina.
Apio ( Apium graveolens)	bergapteno,eugenol, miristiceno,nicotina, rutina, timol, xantotoxina
Orégano ( Origanum vulgare)	Alfa-pineno,alfa-terpineol,alfa-tujeno, limoneno, timol, ocimeno, rutina.
Zanahoria ( Daucus carota)	Alfa-pineno, alfa- terpineol,bergapteno,limoneno, miristicina, xantotoxina
Poleo ( Mentha pulegium)	Alfa-pineno,alfa-terpineol, limoneno,mentona, pulejona, timol
Ortiga ( Urtica dioica)	Rutina, hidroxitriptamina.
Lavanda ( Lavanda officinalis)	Alfa-pineno,alfa-terpineol,alfa-tujeno, limoneno,
Laurel ( Laurus nobilis)	Alfa-pineno,alfa-terpineol,eugenol,limoneno,rutina
Mentha ( Mentha rotundifolia, mentha longifolia, mentha piperita)	Alfa-pineno,alfa-terpineol,limoneno,mentona, pulejona, timol
Cebolla ( Allium cepa)	Alicina, bencilisotiocianato, rutina. disulfuro de dialil,
Ajo ( Allium sativum)	Alicina, linalool, rutina.
Romero ( Rosmarinus officinalis)	Alfa-pineno,alfa-terpineol,alfa-tujeno, limoneno,timol, linalol

2.3. EXTRACTOR SOXHLET

El extractor Soxhlet o simplemente Soxhlet (en honor a su inventor Franz von Soxhlet) es un tipo de material de vidrio utilizado para la extracción de compuestos, generalmente de naturaleza lipídica, contenidos en un sólido, a través de un disolvente afín. [2]

Figura. Estructura de un extractor Soxhlet

2.3.1. Descripción

El condensador está provisto de una chaqueta de 100 mm de longitud, con espigas para la entrada y salida del agua de enfriamiento. El extractor tiene una capacidad, hasta la parte superior del sifón, de 10 mL; el diámetro interior del extractor es de 20 mm y su longitud de 90 mm. El matraz es de 500 mL de capacidad.2

Está conformado por un cilindro de vidrio vertical de aproximadamente un pie de alto y una pulgada y media de diámetro. La columna está dividida en una cámara superior y otra inferior. La superior o cámara de muestra sostiene un sólido o polvo del cual se extraerán compuestos. La cámara de disolvente, exactamente abajo, contiene una reserva de disolvente orgánico, éter o alcohol.²

Dos tubos vacíos, o brazos, corren a lo largo a un lado de la columna para conectar las dos cámaras. El brazo de vapor corre en línea recta desde la parte superior de la cámara del disolvente a la parte superior de la cámara del sólido. El otro brazo, para el retorno de disolvente, describe dos U sobrepuestas, que llevan desde la cámara de la muestra el disolvente hasta la cámara de disolvente. El soxhlet funciona cíclicamente, para extraer las concentraciones necesarias de algún determinado compuesto.²

Éste funciona de la siguiente forma: Cuando se evapora, el disolvente sube hasta el área donde es condensado; aquí, al caer y regresar a la cámara de disolvente, va separando los compuestos hasta que se llega a una concentración deseada.8 Esto puede ocasionar problemas con algunos compuestos, que con los ciclos llevan a la ruptura del balón, como lo es en la extracción del ámbar.2

2.4. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS INSECTICIDAS VEGETALES

2.4.1. Ventajas[3]

1. Son conocidos por el agricultor ya que generalmente se encuentran en su mismo medio.

2. Muchas veces poseen otros usos como medicinales o repelentes de insectos caseros.

3. Su rápida degradación puede ser favorable pues disminuye el riesgo de residuos en los alimentos.

4. Algunos pueden ser usados poco tiempo antes de la cosecha

5. Varios actúan rápidamente inhibiendo la alimentación del insecto aunque a la larga no causen la muerte del insecto.

6. Debido a su acción estomacal y rápida degradación pueden ser más selectivos con insectos plaga y menos agresivos con los enemigos naturales

7. Muchos de estos compuestos no causan fitotoxicidad.

8. Desarrollan resistencia más lentamente que los insecticidas sintéticos.

2.4.2. Desventajas³

1. No todos son insecticidas sino que muchos son insectistaticos lo que los hace tener una acción más lenta

2. Se degradan rápidamente por los rayos ultravioleta por lo que su efecto residual es bajo.

3. No todos los insecticidas vegetales son menos tóxicos que los sintéticos.

4. No se encuentran disponibles durante toda la temporada.

5. Los límites máximos de residuos no están establecidos

6. No hay registros oficiales que regulen su uso.

7. No todas las recomendaciones que manejan los agricultores han sido validadas con rigor científico.

2.5. CUÁLES PLANTAS UTILIZAR

Son muchas las publicaciones que hacen listados de plantas con propiedades insecticidas. Por ejemplo, ya en 1950, Heal et al. Reportan aproximadamente 2.500 plantas de 247 familias con alguna propiedad insecticida o tóxica para insectos. Pero para usarlas, no basta con que una planta sea considerada como prometedora o con probadas propiedades insecticidas. Además se deben hacer análisis de riesgos al medio ambiente y a la salud. Por ejemplo, no es conveniente recomendar el uso de plantas que estén en vías de extinción, que sean difíciles de encontrar o que su utilización implique alteraciones importantes a la densidad en que se encuentran en la naturaleza. Si el día de mañana se descubre que la madera del baoba mata insectos esto no quiere decir que los vamos a cortar. De esta forma y con la finalidad de obtener el máximo provecho de una planta con propiedades insecticidas, sin que ello implique un deterioro al ecosistema, se han enlistado las características que debe tener la planta insecticida ideal 3(Silva, 2001):

1. Ser perenne.

2. Estar ampliamente distribuida y en grandes cantidades en la naturaleza, o bien que se pueda cultivar.

3. Usar órganos de la planta renovables como hojas, flores o frutos.

4. No ser destruida cada vez que se necesite recolectar material (evitar el uso de raíces y cortezas).

5. Requerir poco espacio, manejo, agua y fertilización.

6. Tener usos complementarios (como medicinales).

7. No tener un alto valor económico.

8. Ser efectiva a bajas dosis

2.6. ¿SI ES NATURAL NO ES VENENOSO?

Es un gran error considerar a los productos de origen vegetal y por ende a los insecticidas vegetales como productos inocuos solo por ser naturales. Existe una gran cantidad de productos vegetales que son altamente tóxicos; basta recordar que la historia documenta que Sócrates fue condenado a muerte bebiendo la cicuta (Cicuta spp), que no era otra cosa que un extracto acuoso altamente venenoso de esta planta. Schmutz y Breazeale (1986), en su libro “Plantas que envenenan” señalan alrededor de 120 especies de plantas que contienen alguna sustancia que es tóxica para el ser humano, mencionándose incluso especies tan comunes como el almendro, frejol, ajo, frutilla y manzano, entre otras. En consecuencia, no se debe olvidar que el potencial tóxico de una molécula se debe a la naturaleza de su estructura química y no a su origen. 3

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. LUGAR DE REALIZACIÓN

El presente trabajo de investigación se realizara en el laboratorio de Entomología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica de Machala.

3.1.1. Ubicación

La Facultad de ciencias Agropecuarias se encuentra ubicada a 5 km de la ciudad de Machala en la vía Machala-Guayaquil.

Sus coordenadas geográficas son:

Latitud: 03º 16' Sur

Longitud: 79º 57' Este

Altitud: 6 msnm

3.1.2. Características de la zona

Temperatura media anual: 24,9ºC

Precipitación: 610 mm anuales

Heliofanía: 3 a 4 horas/días

3.2. MATERIALES

- Extractor Soxhlet

- Alcohol industrial

- Balanza

- Agua

- Algodón

- Muestras de: Barbasco (Lonchocarpus nicou L.), Geranio (Gen.: Pelargoniun) y Tabaco (Nicotiana tabacum)

- 2 frascos de plástico color ámbar

- Libreta de apuntes

- Vaso de precipitación

- Adherente 1ml

- Jabón potásico 2ml

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Extracción de hojas de geranio (Gen.: Pelargoniun)

- Secar al aire libre las hojas de las plantas a utilizar.

- Triturar las hojas secas de geranio, que queden en trozos muy pequeños, para poder introducir con facilidad en los dedales (cartucho poroso) del extractor Soxhlet.

- Pesar los dedales (2) que contienen las hojas de geranio trituradas finamente, y tapar con una pequeña capa de algodón el la entrada de los dedales.

- Introducir los dos dedales, en el extractor Soxhlet, y agregar 200 ml de alcohol industrial que actuara como solvente.

- Abrir la llave de entrada de agua que actúa como refrigerante del extractor.

- Encender, la estufa y ajustar para que la extracción este en 2 a 3 horas, teniendo en cuanta que el extractor no debe calentarse mucho y con rapidez.

- Dejar enfriar, el extractor cuando se haya observado que el disolvente (alcohol industrial) haya empezado a hervir y haya obtenido una coloración pardusca (oscura).

- Retirar los matraz, y obtener el volumen del extracto, registrarlo en la libreta de registro.

- Agregar la sustancia a las botellas de color ámbar, por separado.

- Retirar los dedales del extractor y limpiarlos, cuyo residuos guardar para poder obtener su peso, por separado.

3.2.2. Extracción de hojas de tabaco (Nicotiana tabacum)

- Obtener cigarrillos, del cual se desmenuzaron eliminando el filtro, para no mezclar con hojas a obtener.

- Pesar los dedales (2) llenos con las hojas de tabaco, y tapar con una pequeña capa de algodón el la entrada de los dedales.

- Introducir los dos dedales, en el extractor Soxhlet, y agregar 200 ml de alcohol industrial que actuara como disolvente.

- Abrir la llave de entrada de agua que actúa como refrigerante del extractor.

- Encender, la estufa y ajustar para que la extracción este en 2 a 3 horas, teniendo en cuenta que el extractor no debe calentarse mucho y ni con rapidez.

- Dejar enfriar, el extractor cuando se haya observado que el disolvente (alcohol industrial) halla empezado a hervir y haya obtenido una coloración pardusca (oscura).

- Retirar los matraz, y obtener el volumen del extracto, registrarlo en la libreta de registro.

- Agregar la sustancia a las botellas de color ámbar, por separado, las cuales ya tenían la sustancia extraída de las hojas de geranio.

- Retirar los dedales del extractor y limpiarlos, cuyo residuos guardar para poder obtener su peso, por separado.

3.2.3. Extracción de las raíces de Barbasco (Lonchocarpus nicou L)

- Secar las raíces al aire libre.

- Moler las raíces de barbasco, en un molino manual, las cuales deben ser tamizadas, para que queden fragmentos muy finos, prácticamente un polvo.

- Pesar los dedales (2) llenos con el polvo de barbasco, y tapar con una pequeña capa de algodón el la entrada de los dedales.

- Introducir los dos dedales, en el extractor Soxhlet, y agregar 200 ml de alcohol industrial que actuara como disolvente.

- Abrir la llave de entrada de agua que actúa como refrigerante del extractor.

- Encender, la estufa y ajustar para que la extracción este en 2 a 3 horas, teniendo en cuenta que el extractor no debe calentarse mucho y ni con rapidez.

- Dejar enfriar, el extractor cuando se haya observado que el disolvente (alcohol industrial) halla empezado a hervir y haya obtenido una coloración pardusca (oscura).

- Retirar los matraz, y obtener el volumen del extracto, registrarlo en la libreta de registro.

- Agregar la sustancia a las botellas de color ámbar, por separado, las cuales ya tenían las sustancias extraídas de las hojas de geranio y tabaco.

- Retirar los dedales del extractor y limpiarlos, cuyo residuos guardar para poder obtener su peso, por separado.

- Agregar 1ml de adherente, y 2ml jabón potásico, en cada botella.

- Aforar cada botella con agua, una ves mezcladas las tres sustancias (geranio, tabaco y barbasco) en cada botella.

- Medir el pH de cada insecticida vegetal.

4. RESULTADOS

Cuadro 1. Obtención de los extractos de diferentes órganos de tres plantas, mediantes el extractor Soxhlet.

Órgano	Planta	Peso de dedales		Disolvente	Volumen de dedales
Órgano	Planta	D1+ P	D2+P*	Alcohol ind.	D1	D2**
Hoja	Geranio	9,30	12,93	200,00 ml	224,00	224,00
Raíz	Barbasco	49,33	35,98	200,00 ml	212,50	215,00
Hoja	Tabaco	5,29	6,14	200,00 ml	225,00	225,00
Total del producto					661,50	664,00
Adherente					1,00	1,00
Jabón potásico					2,00	2,00
Agua					335,50	333,00

* P= Planta

** D= Dedal

Cuadro 2. Determinación de sus compuestos orgánicos y metabolitos secundarios, mediante revisión bibliográfica de los extractos obtenidos

Órgano	Planta	Compuesto orgánico	Metabolito secundario
Hoja	Geranio	Citronelol	Monoterpenoide
Raíz	Barbasco	Rotenona	Flavonoide
Hoja	Tabaco	Nicotina	Alcaloide

5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

5.1. DISCUSIÓN

La nicotina es un alcaloide derivado especialmente de tabaco y este compuesto no se encuentra en la planta en forma libre sino que formando maleatos y citratos y es básicamente un insecticida de contacto no persistente, en cambio el barbasco es flavonoide extraída de las raíces de estas plantas de la que se puede obtener un 13% de rotenona, este compuesto es un insecticida de contacto e ingestión, y repelente.

Los insecticidas naturales a partir de extractos vegetales constituyen una muy interesante alternativa de control de insectos además de que sólo se han evaluado muy pocas plantas en relación a la fuente natural que ofrece el planeta, por lo que las perspectivas futuras en cuanto a investigación, son aun mayores.

5.2. CONCLUSIÓN

De acuerdo a las condiciones del medio donde se desarrollo la práctica y la bibliografía citada, concluimos que:

- El barbasco produce un compuesto orgánico llamado rotenona, el geranio produce el Citronelol y el tabaco produce nicotina.

- Muchas plantas son capaces de sintetizar metabolitos secundarios que poseen propiedades biológicas con importancia contra insectos plagas.

- Los insecticidas obtienen una rápida degradación, que puede ser favorable pues disminuye el riesgo de residuos en los alimentos.

6. BIBLIOGRAFÍA

FUNSALPRODESE (Fundación salvadoreña para la promoción Social y el desarrollo económico). 2000. Elaboración de plaguicidas orgánicos. San Salvador. Recuperado el 16 de enero de 2013 de la página web: http://www.funsalprodese.org.sv/PDF/Bolet%C3%ADnes%20Informativos/Plaguicidas_organicos.pdf

FONAG (Fondo para la Protección del Agua). 2010. Abonos orgánicos protegen el suelo y garantizan alimentación sana. Manual para la elaborar y aplicar abonos y plaguicidas orgánicos. Recuperado el 16 de enero de 2013 de la página web: http://www.fonag.org.ec/doc_pdf/abonos_organicos.pdf

PAGINAS WEB:

1. http://www.botanical-online.com/plantasinsecticidas.htm#listado

2. http://es.wikipedia.org/wiki/Extractor_Soxhlet

3. http://ipmworld.umn.edu/cancelado/Spchapters/GsilvaSp.htm

ANEXOS